重组人源超氧化物比方化酶钻研妨碍（二）

二、重组钻研经由基因突变改善

SOD的人源功能hCu/Zn-SOD作为抗氧化酶可能减轻活性氧逍遥基对于细胞的伤害，且不会引起免疫反映，超氧可是化物化酶hCu/Zn-SOD的大规模破费以及临床运用受到产量以及可溶性的限度。经由定点突变修正hCu/Zn-SOD的比方一些氨基酸残基可能改善其产量以及品质。

hCu/Zn-SOD搜罗2个亚基，妨碍每一个亚基又搜罗4个半胱氨酸（Cys）残基，重组钻研其对于应的人源位置分说是六、5七、超氧111以及146，化物化酶其中Cys57以及Cys146之间组成份子内二硫键，比方6位以及111位是妨碍游离的半胱氨酸残基。周赞虎等运用PCR定点突变技术把hCu/Zn-SOD基因的重组钻研Cys111明码子渐酿成Ala111明码子，经由随机同源重组将突变后的人源hCu/Zn-SOD整合到聚球藻Synechococcussp.PCC7942中并实现表白，表白产物在80℃保温30min后仍具备95%的超氧去世气愿望，耐热能耐比做作hCu/Zn-SOD有了较大的后退。张琨等经由重叠PCR技术将做作hCu/Zn-SOD基因的Cys6明码子渐酿成Ala6明码子，Cys111明码子渐酿成Ser111明码子，经由大肠杆菌重组表白患上到改构体卵白rmhCu/Zn-SOD6Ala,111Ser，从1g湿菌体中取患上的活性卵白总量高于未改构体的2倍，改构体的热晃动性也取患上大幅度后退。高淑彬分说构建做作hCu/Zn-SOD以及Cys111渐酿成Ala111的突变hCu/Zn-SOD表白载体，并在大肠杆菌中表白，其表白量都占菌体总卵白的45%以上，突变hCu/Zn-SOD酶去世气愿望以及晃动性均高于做作hCu/Zn-SOD，证实经由基因突变可能改善酶的功能。经由随机整合方式将突变的hCu/Zn-SOD基因整合到蓝藻Synechoccussp.PCC7942染色体上，植物试验证实转突变hCu/Zn-SOD基因的蓝藻口服后具备较强的抗氧化熏染，为进一步钻研开拓半衰期长的可直接口服的hCu/Zn-SOD奠基了根基。Zhang等将hCu/Zn-SOD的6位以及111位的半胱氨酸（C）渐酿成丝氨酸（S），构建了3个突变体mhSOD1/C6S、mhSOD1/C111S以及mhSOD1/C6S/C111S。服从表明，与家养型比照，除了C6S突变使重组卵白可溶性表白飞腾之外，C111S以及C6S/C111S突变均能添减轻组卵白在大肠杆菌中的可溶性表白，进而后退重组卵白的产量，且C111S突变下场优于C6S/C111S。此外，mhSOD1/C111S展现了更低的毒性以及更强的美白以及抗辐射活性。因此，C111S突变是工业化大规模破费以及开拓重组人源SOD的一个实用策略。

三、经由融会卵白技术改善

SOD的功能融会卵白技术是指运用基因工程技术，将两段或者多段编码功能卵白的基因有目的地衔接在一起并妨碍表白，从而发生一种新的家养融会卵白的措施。由相对于较小的妄想域拼装成较大的多功能卵白是做作进化的一个严主因素。因此，在基因水平上将差距的妄想域妨碍衔接，而且使其表告竣融会卵白，是组成多功能卵白、飞腾原卵白毒副熏染及刷新做作卵白的紧张措施。由于有新功能卵白退出，融会卵白的功能被优化，并发生新的生物功能以及活性，以是这种新型的家养卵白具备紧张的实际意思以及潜在的运用价钱。

一、PTD-SOD融会卵白

细胞膜上不专一的SOD通道或者受体，外源SOD难以进入细胞内发挥抗氧化熏染，因此限度了其临床运用。HIV-1反式激活卵白TAT的卵白转导妄想域是一种广谱的能照料大份子物资穿透植物细胞膜的小份子多肽，可能处置SOD卵白透膜相关难题。PTD可能向导多种多肽以及卵白进入目的细胞，具备转导速率快、功能高以及温度顺应性广等短处，且可能透过血脑屏障。大部份PTD或者与PTD共价散漫的卵白在跨详尽胞膜后转运到细胞核而不是细胞质或者其余细胞器，因此PTD运输零星只适用于在细胞核内发挥功能的药物份子的转运。王宇等钻研PTD4介导的Cu/Zn-SOD对于大鼠心肌细胞缺氧-复氧伤害（HRI）的影响，发现重组的PTD4-Cu/Zn-SOD融会卵白可能清晰削减HRI导致的细胞凋亡，从而减轻大鼠心肌细胞的HRI，证明了重组PTD4-Cu/Zn-SOD可能高效穿透心肌细胞，改知己肌细胞缺血再贯注伤害。Yao等在骨癌钻研中发现，活性氧在确定水平上退出了肿瘤痛苦悲痛的睁开以及不断，而重组PTD-Cu/Zn-SOD可能削弱这种熏染，因此其在骨癌治疗中可作为一种潜在的辅助治疗剂。Zhang等将所取患上的Mn-SOD、PTD-Mn-SOD以及脂质体Mn-SOD用于呵护人脐静脉内皮细胞（HUVECs）氧化伤害，服从发现，与做作Mn-SOD比照，PTD-Mn-SOD以及脂质体Mn-SOD可发挥更强的药理熏染。孟丽华以及薛荣亮经由检测PTD4-Cu/Zn-SOD进入人星形胶质细胞内的荧光卵白的扩散情景，发现PTD4-Cu/Zn-SOD融会卵白可能穿详尽胞膜，且可能飞腾因细胞缺氧伤害所致的细胞凋亡。PTD与SOD妨碍融会的措施重大易行，可提供大批重价、清静、高活性的重组SOD废品。需要夸张的是，尽管PTD-Cu/Zn-SOD融会卵白具备精采的穿透细胞膜特色，但不机关特异性，若是静脉给药可能会快捷导入血管内皮细胞或者血细胞，不能很好地抵达靶区发挥熏染，因此需要进一步改善妄想或者给药道路以处置其靶向下场。

二、PEP-SOD融会卵白

PEP-1是一种家养妄想的主要用于转导大份子卵白的细胞穿透肽，它能高功能地照料具备治疗下场的卵白进入细胞并发挥其生物学效应。Liu等构建了表白PEP-1-hMnSOD融会卵白的表白载体，并在双比方杆菌中乐成表白了PEP-1-hMnSOD融会卵白。在进一步临床钻研中，将透膜性以及晃动性较差的hMnSOD经由PEP-1递送到结肠炎症细胞内，经由对于炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-8水平以及结肠机关学伤害检测，发现PEP-1-hMnSOD融会卵白可能实用地减轻葡聚糖硫酸钠诱惑的溃疡性结肠炎。因此口服表白PEP-1-hMnSOD融会卵白的双比方杆菌工程菌可作为治疗溃疡性结肠炎的新措施。

神经干细胞移植已经被证实是一种潜在的治疗创伤性脑伤害的策略。Jia等探究NSCs移植配合PEP-1-SOD1配合治疗大鼠脑缺血的可能性。体外试验证实，PEP-1-SOD1能后退神经干细胞的增殖以及分解；体内试验表明，与径自NSCs移植比照，PEP-1-SOD1散漫NSCs移植策略对于大鼠TBI后的功能复原有清晰的增长熏染。Yoo等品评辩说了Cu/Zn-SOD对于脂肪机关源头间充质干细胞抗脊髓缺血伤害的增长熏染。服从展现PEP-1-SOD1以及Ad-MSCs散漫运用进一步增强了Ad-MSCs对于神经元缺血伤害的呵护熏染。相对于PTD融会卵白，PEP融会卵白具备其配合优势。PTD融会卵白进入细胞后，所照料的功能卵白需要在细胞内份子同伙HSP90的帮手下重折叠能耐发挥其生物学效应，靶卵白的生物活性依赖于细胞内HSP90的重折叠功能，因此PTD融会卵白技术的临床运用受到了确定限度。而PEP融会卵白可能直接照料具备生物活性的功能卵白进入细胞发挥生物学效应，同时它还具备转导功能高、无毒性及不受血清影响等优势，这使细胞穿透肽PEP在运用上更具备后劲，可能成为更适宜于卵白治疗的载体工具。

三、多功能融会卵白

钻研者们曾经试验将差距功能的卵白与SOD妨碍组合，将差距卵白的优势以及特色融会在一起，以给予目的卵白多种新的属性以及功能。周宇飞等为了增强胸腺素α1（Thyα1）的晃动性以及免疫功能，接管胸腺素α1与人源SOD融会的策略，构建了6His-hSOD-(G4S)1-Thyα1以及6His-hSOD-(G4S)2-Thyα1两个融会基因，并在毕赤酵母中实现为了高水平表白。重组表白的融会卵白经由进一步纯化后妨碍了活性检测，服从表明这两个融会卵白既有SOD的活性，又有Thyα1的活性。盛显明等接管基因工程技术经由大肠杆菌制备一种兼具人源SOD以及过氧化氢酶（CAT）活性的多功能融会卵白CAT-PTD-SOD，该融会卵白大部份以兼具SOD以及CAT活性的可溶方式存在。在0.033mol/L、致使0.067mol/L的H2O2溶液中，SOD活性在20min内无清晰着落，证实其具备抗氧化以及分解过氧化氢的双重熏染。潘剑茹等构建了SOD1以及穿膜肽R9的融会卵白表白质粒GST（谷胱甘肽巯基转移酶）-SOD1-R9，经由大肠杆菌BL21（DE3）表白出具备双效抗氧化功能的GST-SOD1-R9融会卵白。该融会卵白不光可能翦灭过剩的活性氧逍遥基，而且还可能修复或者翦灭体内已经被氧化伤害的生物份子，并再生氧化伤害的含巯基卵白。Pan等钻研了GST-TAT-SOD对于顺铂伤害细胞的呵护熏染，证实GST-TAT-SOD经由直接翦灭过剩的细胞内逍遥基以及增强细胞抗氧化侵略，可能破除了顺铂治疗引起的妨碍抑制以及细胞凋亡，因此GST-TAT-SOD可能作为顺铂诱惑的细胞伤害的呵护剂。此外，Pan等还经由小鼠全身X射线辐射试验，表明双功能GST-TAT-SOD对于X射线辐射所致伤害有确定的防护熏染，可能实用后退小鼠脾脏以及肝脏的抗氧化能耐、脾脏白髓数目以及胸腺指数等，不灼烁晰后退了X射线辐照小鼠体重削减率，而且后退了接受致去世量映射小鼠的存活率。GST-TAT-SOD的部份下场比阿米福汀好一些，以是GST-TAT-SOD可作为一种清静的辐射防护剂。

Luangwattananun等妄想并研制了三功能融会卵白CAT-CuZnSOD/6His-CuZnSOD-TAT（CS/S-TAT），与其以前妄想的6His-MnSOD-TAT/CAT-MnSOD（M-TAT/CM）比照，份子巨细减小42%，其SOD以及CAT活性分说后退22%以及99%。在70℃孵育10min后，CS/S-TAT保存了54%的残余SOD活性，而M-TAT/CM的SOD活性残缺消除了。此外，在70℃时，CS/S-TAT的半衰期比M-TAT/CM后退了5倍。该酶可能跨膜进入哺乳植物细胞，可作为氧化伤害细胞的呵护剂或者治疗剂。因此，这项使命为妄想以及分解一种更晃动的多功能抗氧化酶提供了参考。总之，多功能的融会卵白在抗氧化方面，每一每一比繁多的抗氧化卵白具备更大的优势。因此，融会卵白的重大优势使其有望成为新一代抗氧化药物的有力相助者，为开拓高功能抗氧化卵白开拓了新道路。

四、总结与展望

SOD是生物体内一种紧张的氧逍遥基翦灭剂，具备紧张的生物学功能。良多疾病（如肌萎缩侧索硬化、动脉硬化灵通症、肿瘤转移以及熏染性疾病等）的发生以及睁开与SOD缺少或者不精确折叠无关。随着SOD钻研不断深入以及工业化破费规模逐渐扩展，SOD还被运用于化学、生物学、食物迷信以及植物病害提防等多个规模。可是受做作SOD的理化性子所限，如静脉注射后体内半衰期仅为6min，口服后在胃肠道中简略被破损而患上到疗效，膜透过率低等，这些因素使其在运用方面受到了很大的限度。当初，人们对于SOD卵白妨碍了化学修饰、家养有机分解SOD模拟物以及运用基因工程法制备SOD等方面的探究，普遍以为经由基因工程制备重组人源SOD是最为经济、快捷、实用且清静的措施。随着今世生物技术的快捷睁开，国内外在微生物发酵破费重组SOD的菌种选育、高产菌开拓以及发酵工艺的优化等方面都取患了确定妨碍。经由基因工程技术破费重组人源SOD，既飞腾了其余源头SOD的免疫原性下场，又处置了人源SOD的源头下场，而且可能克制传统工艺限度，使人们可能凭证自己的被迫定向刷新目的卵白。随着钻研的进一步深入，基于基因工程主导的生物工程将逐渐增长重组SOD实现财富化，运用SOD开拓的产物也将会患上到加倍普遍的运用。

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